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www.zl600.com蛋白质糖基化途径的酶类

时间:2020-01-29

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  在T.reesei QM9414的质膜组分中发现了长醇激酶(DolK),该酶催化γ-磷酸基团从CTP转移到长醇分子上(Kruszewska et al.,1994)。在S.cerevisiae中,发现DolK在可利用的脂类媒介物调控方面起主要作用(Heller et al.,1992),由此调节糖基化的效率。与DPM合成酶不同的是,T.reesei QM9414的DolK活性不受培养基中葡萄糖的影响,提高培养温度(35℃),菌丝中的DolK活性大幅度提高,其他参与蛋白质O-甘露糖基化的酶活性也同样大幅度上升,但对DPM合成酶和蛋白质甘露糖基转移酶来说,其活性的提高只有在外源长醇磷酸酯缺乏时才明显(表11.3),表明在高温培养时,菌丝细胞质膜中的长醇含量和长醇磷酸酯含量都增加。从35℃培养的T.reesei中提取的总脂能够提高DolK活性(DolK提取自25℃培养的T.reesei)进一步证明了以上现象的存在。可见,温度能够影响细胞质膜中的长醇含量。

  表11.3 温度对参与T.reesei QM9414蛋白质O-甘露糖基化反应的各种酶活性的影响

  Kruszewska等(1990)发现T.reesei QM9414胞外蛋白质的分泌可被胆碱和吐温80促进,这种促进作用与DPM合成酶活性的大幅度提高有关。当真菌培养在碳源分解产物解阻遏型培养基上时,这种效应就更加明显,例如用乳糖替代葡萄糖作为碳源。有趣的是,当胆碱或者吐温80存在时,菌株RUT C-30的DPM合成酶活性下降,但其蛋白分泌不受影响;同时,体外测定时胆碱或者吐温80 对 DPM 合成酶的影响消失。还观察到只有DPM合成酶的活性发生了显著变化,而其他位于内质网上的糖基化酶活性没有受到影响。与酵母和动物细胞中的类似酶一样,木霉的DPM合成酶活性在体外试验时也为磷脂酰胆碱(PC)所促进。www.zl600.com!由此推测,DPM合成酶活性的增加是由内质网膜中磷脂酰胆碱的富集所引起的。但从另一方面来看,T.reesei QM9414和RUT C-30胞内质膜中的PC浓度并未发现显著差异。

  根据胆碱和吐温80对蛋白质分泌及DPM合成酶活性的影响情况,有人提出DPM合成酶活性可能是T.reesei蛋白质分泌的限速节点(Kruszewska et al.,1989,1990)。为了寻找这种看法的分子证据,构建了 T.reesei的一个重组菌株,该重组菌株含有来自S.cerevisiae的dpm1基因(编码DPM合成酶),基因置于T.reesei的组成型启动子下。与亲本菌株相比,重组菌株的DPM合成酶活性有一定程度的增加,纤维素酶分泌量大约增加了10倍,CBHI量增加了6倍(Kruszewska et al.,1997)。将重组基因置于木霉的强启动子之下是广泛应用的技术,利用该技术进一步研究了蛋白质分泌的促进效应,发现S.cerevisiae的DPM至少在细胞的3个生化步骤上起重要作用(Orlean,1990):①提供甘露糖残基供体,在N-糖苷键合成过程中以供连接在长醇磷酸酯上的寡糖链延长;②提供第一个O-糖苷键连接的甘露糖残基;③合成磷脂酰肌醇(PI)锚定物的糖基团,该锚定物在质膜上锚定一些蛋白质。

  除了作为脂-聚糖媒介外(例如DolPP-GlcNAc2Man9 Glc3),GDP-甘露糖也是N-和O-连接的聚糖合成中甘露糖的供体。现在已知第一组5个甘露糖残基直接从GDP-Man加在长醇连接的二寡糖上(DolPPGlcNAc2),反应发生的位置在内质网的溶质区域,而随后的4个甘露糖残基则来自内质网腔区域的 DPM(Abeijon et al.,1992;Herscovics et al.,1993;Tanner et al.,1987)。在高等真核生物细胞中(例如视网膜和甲状腺组织细胞),GDPMan不仅仅是甘露糖基转移酶的底物,也间接促进非甘露糖GlcNac-脂类的生物合成(Kean,1980;Ronin et al.,1981)。Kruszewska等(1990)曾经报道了T.reesei 中GDP-Man对蛋白质O-糖基化的间接促进作用,并自T.reesei分离到了编码鸟苷酰转移酶的一个cDNA片段。核苷酸序列分析表明,该克隆有一个1.6 kb的开放阅读框,推定的编码蛋白包含354个氨基酸,两者与S.cerevisiae鸟苷酰基转移酶编码基因(mpg1)及其蛋白的同源性分别为81%和71%(Kruszewska et al.,1998)。Zakrzewska等(2003)将来自T.reesei的编码 GTP和长醇基磷酸甘露糖合酶(DPMS)的基因 mpg1和dpm1 分别在T.reesei中过表达,结果发现在 dpm1 过表达的转化子中 DPMS 活性没有明显提高,而mpg1过表达的转化子中GDP-甘露糖(GDPMan)的水平提高了2倍。甘露糖基转移酶以甘露糖为底物,导致糖基化的分泌蛋白高度甘露糖基化。Mpg1过表达提高了dpm1的转录水平和DPMS活性,这说明细胞内甘露糖水平在T.reesei分泌蛋白的糖基化过程中有重要作用。



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